Питер Сарноу тарабынан редакцияланган, Стэнфорд университетинин Медицина мектеби, Стэнфорд университети, Калифорния, 2020-жылдын 25-декабрында бекитилген (2020-жылдын 25-октябрында каралган)
Биз репликация жана эволюциялык сактоо үчүн маанилүү болгон коронавирустардын транскрипция комплекстеринин репликациясындагы суббирдиктердин өз ара аракеттенүүсү жөнүндө кабарлайбыз.Биз nsp12 менен байланышкан NiRAN доменинин транс нуклеозиддик монофосфат (NMP) трансфераза активдүүлүгүнө ээ экендигин далилдедик жана анын бутасы катары nsp9 (РНКны байланыштыруучу протеин) аныкталган.NiRAN Mn2+ иондоруна жана жанаша сакталган Asn калдыктарына таянган реакцияда NMP бөлүгүнүн консервацияланган nsp9 амино терминалына коваленттүү кошулушун катализдейт.NiRAN активдүүлүгү жана nsp9 NMPylation коронавирустун репликациясы үчүн маанилүү экени аныкталган.Маалыматтар уя салынган вирус ферментинин маркеринин бул активдүүлүгүн РНК вирустарынын классында РНК синтезинин башталышы функционалдык жана эволюциялык жактан шайкеш келет деген гипотезадагы мурунку байкоолор менен байланыштырууга мүмкүндүк берет.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae жана башка 12 үй-бүлө) РНКга көз каранды РНК полимеразасы (RdRps) NiRAN деп аталган полипротеинден бөлүнүп чыккан структуралык эмес белоктун (nsp) амин-терминалдык (N-терминал) домени менен байланышкан. 1ab вирустук негизги протеазадан (Mpro) турат.Буга чейин, NiRAN-RdRp nsp артериялык вирусунун өзүнүн GMPylation/UMPylation активдүүлүгү кабарланган жана нуклеозиддик монофосфатты (NMP) вируска (учурда белгисиз) жана/же клетка биополимеризациясы Things өткөрүп берүү үчүн өтмө процессти түзүү сунушталган.Бул жерде биз коронавирустун (Адам Coronavirus [HCoV]-229E жана катуу курч респиратордук синдрому Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+ көз каранды NMPylation активдүүлүгүн көрсөтөт, ал nsp9дан Mpro ортомчу nsp9 пайда болушу аркылуу алынган. N-терминал капталдагы nsps протеолитикалык жактан бөлүнүп чыгат, фосфорамидат nsp9 N-терминалында биринчилик амин (N3825) менен байланышкан.Уридин трифосфат бул реакцияда артыкчылыктуу нуклеотид, бирок аденозин трифосфат, гуанозин трифосфат жана цитидин трифосфат да ылайыктуу ко-субстрат болуп саналат.Рекомбинантты коронавирус nsp9 жана nsp12 протеиндерин жана гендик инженерияланган HCoV-229E мутанттарын колдонуу менен мутацияларды изилдөө NiRAN аркылуу nsp9 NMPylation жана клетка маданиятында вирустун репликациясы үчүн зарыл болгон калдыктарды аныктады.Маалыматтар NiRAN активдүү сайтынын калдыктары жөнүндө божомолду ырастады жана nsp9 N3826 калдыктарынын nsp9 NMPylation жана in vitro вирустун репликациясында маанилүү ролун аныктады.Бул калдык консервацияланган N-терминал NNE трипептид ырааттуулугунун бир бөлүгү болуп саналат жана nsp9 жана анын гомологдорунун коронавирус үй-бүлөсүндө жалгыз инварианттык калдыгы болуп чыкты.Бул изилдөө башка уяланган вирустардын NMPylation активдүүлүгүн функционалдык изилдөө үчүн бекем негиз түзөт жана вируска каршы дарыларды иштеп чыгуу үчүн мүмкүн болуучу максаттарды сунуштайт.
Nidovirales оң тилкелүү РНК вирусу ар кандай омурткалуу жана омурткасыз жаныбарларды жугат (1, 2).Учурда буйрук 14 үй-бүлөнү (3) камтыйт, алардын ичинен коронавирустун үй-бүлөсү акыркы 20 жылда кеңири изилденген.Ошол кезде жаныбарлардын ээлеринен үч зооноздук коронавирус пайда болуп, адамдарда катуу респиратордук инфекциялардын кеңири масштабдуу чыгышына себеп болгон.Анын ичинде катуу курч жугуштуу оорулардан келип чыккан туруктуу пандемиялар.Респиратордук синдром Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовирустар жалпы геномдук уюмду бөлүшөт жана мембрана менен байланышкан репликация-транскрипция комплексинин (RTC) суббирдиги 5-?²-терминалынын үчтөн экисинде жана вирус бөлүкчөсүнүн негизги структуралык суббирдигинде, ошондой эле кээ бир аксессуарларда коддолгон. .Протеин, геномдун 3??² акыркы үчтөн бир бөлүгүндө коддолгон (1).Планардык вирустардын (Monoviridae) (8) бир үй-бүлөсүнөн тышкары, бардык уя салынган вирустар RTC суб-бирдиктерин эки чоң ачык окуу рамкаларында (ORF) ORF1a жана ORF1b коддойт, алар геномдук РНКдан которулат.ORF1a полипротеинди коддойт (pp) 1a, жана ORF1a жана ORF1b биргелешип pp1ab коддошот.ORF1a тарабынан коддолгон негизги протеазанын (Mpro) жалпы катышуусу менен pp1a да, pp1ab да протеолиттик түрдө түрдүү структуралык эмес протеиндерге (nsps) иштетилет, ошондой эле 3CLpro деп да белгилүү, анткени ал пикорнавирустун 3Cpro менен гомологияга ээ. 9).Бул nsps чоң динамикалык RTCге чогулуп, геномдук РНКнын синтезин (репликация) жана субгеномдук РНКнын (транскрипция) топтомун катализдейт жана ORF1b агымынын ылдый жагында жайгашкан ORF экспрессиясын координациялоо үчүн колдонулат (10? ?12).
Негизги RTC РНКга көз каранды РНК полимеразаны (RdRp) (13), суперфамилия 1-геликазаны (HEL1) (14, 15) жана бир нече РНКны иштетүү ферменттерин камтыйт, алар негизинен ORF1b жана коронавирус үй-бүлөсүндө коддолгон Ал nsp12-nsp16 жана камтыйт. nsp9-nsp12 Arterioviridae үй-бүлөсүндө (10ââ 12 шилтемесин караңыз).RdRp жана HEL1 канаттуулардын уясынын вирусунун эки (бештен бир) сакталган домендерин билдирет жана башка РНК вирустарынын арасында гомологияга ээ.Негизги репликазага башка суббирдиктер, анын ичинде pp1aнын карбокси-терминал (C-терминал) аймагынан, Mpro агымынын ылдый жагында (тиешелүү түрдө коронавирус nsp5 жана артериялык вирус nsp4) бөлүнүп чыккан бир нече кичинекей nsps жардам берет деп ишенишет.Алар чектелген үй-бүлөгө тиешелүү коргоого жана ар түрдүү иш-аракеттерге ээ (10ââ12 шилтемеде каралат).
Салыштырмалуу жакында, уникалдуу ырааттуулук мотивинин мүнөздөмөлөрү бар домен RdRp менен чектеш болгон бардык уюшкан вирустарда табылган, бирок башка РНК вирустарында жок (16).Анын жайгашкан жерине жана нуклеотиддик трансферазанын (нуклеозид монофосфат [NMP] трансфераза) активдүүлүгүнө жараша бул домен NiRAN (Nestvirus RdRp менен байланышкан нуклеотиддер трансфераза) деп аталат.NiRAN-RdRp кош домендик айкалышы Coronaviridae үй-бүлөсүндө nsp12 жана Arterioviridae үй-бүлөсүндө nsp9 түзөт, ал эми башка nestoviridaeде NiRAN-RdRp вирустук полипротеинден көз карандысыз nsp катары чыгышы күтүлүүдө.Коронавируста NiRAN домени ??1/450 калдыктарды камтыйт жана C-терминал RdRp доменине шилтеме берүүчү аймак аркылуу туташтырылган (16?19).Жылкы Артеритит Вирусунда (EAV) (Arteriviridae) рекомбинант nsp9 Mn2+ ионуна көз каранды (өзүн-өзү) UMPylation жана GMPylation иш-аракеттерин көрсөтөт, алар нестовируста, AN, BN жана CN ырааттуулугунда сакталган үч ырааттуулук негиздерине көз каранды.Бул жерде N NiRAN дегенди билдирет) (16).Бул мотивдердин N-терминалдык капталдары азыраак консервативдүү мотив preAN.Бул калдыктардын кээ бирлери алыскы протеин киназаларында да сакталат, мында алар нуклеозид-трифосфатты (NTP) байланыштырууга жана каталитикалык активдүүлүккө катышары далилденген (20, 21).Бул байкоого ылайык, Pseudomonas syringae псевдокиназасындагы бир нече негизги активдүү сайт калдыктары жакында жарыяланган SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 суперкомплекси менен чогултулушу мүмкүн.Консервацияланган Coronavirus NiRAN калдыктары электрондордун микроструктурасында жайгашкан.Рекомбинантты белок (17).Документтелген (өзүнчө) U/GMPylation NMPти (учурда белгисиз) субстратка өткөрүү үчүн убактылуу абалды жаратат деп болжолдонууда (16) жана NiRAN менен протеинкиназанын ортосундагы структуралык окшоштук (17, 19) ) Бул гипотеза NiRAN башка белокторду өзгөртөт.
Көптөгөн өзгөчөлүктөр, анын ичинде анын уникалдуу жана уникалдуу системалык байланышы, анын ичинде уя салынган вирустар жана RdRpден генетикалык бөлүнүү, NiRANды уя салынган вирустар үчүн акылга сыярлык негизги жөнгө салуучу фермент кылат, бул алардын пайда болушу жана идентификациясы үчүн маанилүү.Мурда геномду/субгеномдук которууну же репликацияны/транскрипцияны жөнгө салуу үчүн NiRAN камтыган үч мүмкүн болгон функция деп аталган.Учурдагы жетишсиз жана толук эмес маалыматтарды эске алганда, ар бир функциянын өзүнүн артыкчылыктары жана кемчиликтери бар (16).Бул изилдөөдө биз эки тукумду билдирген коронавирустардын биохимиялык жана тескери генетикалык изилдөөлөрүн айкалыштырууну жана бул сырдуу чөйрөнү түшүнүү үчүн өз тыянактарыбызды коронавирустун үй-бүлөсүнүн табигый мутациясынын эволюциялык фонуна коюуну максат кылабыз.Биз RTCдеги табигый максаттарды аныктоо аркылуу NiRANды түшүнүүдөгү негизги жетишкендиктерди билдиребиз, ал (колдо болгон үч гипотезанын арасында) уяланган вирус РНКсынын синтезин баштоодо бул домендин ролуна салым кошот.Бул изилдөө ошондой эле вирус хостунун интерфейсинде NiRANдын башка ролдору үчүн мүмкүнчүлүктөрдү ачат.
Корона вирусунун nsp12 менен байланышкан NiRAN доменинин ферментативдик касиеттерин мүнөздөш үчүн биз E. coliде адамдын 229E (HCoV-229E) nsp12 коронавирусунун рекомбинантты түрүн чыгардык, анын C-терминалында His6 теги менен жана [α32-P ] менен протеин Материалдар жана методдордо сүрөттөлгөндөй MnCl2 катышуусунда NTP менен бирге инкубациялоо.Реакция продуктунун анализи nsp12 (106 кДа) менен бирге миграцияланган радиобелгиленген протеиндин бар экендигин көрсөттү, бул коронавирус nsp12 уридин монофосфат (UMP) менен артыкчылыктуу түрдө түзүлгөн коваленттүү протеин-NMP кошулмаларынын пайда болушун катализдейт (сүрөт 1А) жана B).Сандык талдоо көрсөткөндөй, башка нуклеотиддер менен салыштырганда, UMP инкорпорациясынын сигнал интенсивдүүлүгү 2-3 эсеге көбөйгөн (Figure 1C).Бул маалыматтар коронавирустун NiRAN доменинин болжолдонгон NMP трансфераза активдүүлүгүнө шайкеш келет (16), бирок коронавирустун жана артериялык вирустун NiRAN доменинин нуклеотиддик артыкчылыктары ар кандай экенин көрсөтүп турат.
HCoV-229E nsp12 өзүн-өзү NMPylation активдүүлүгү.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа) дайындалган [α-32P] NTP менен 6 mM MnCl2 катышуусунда 30 мүнөткө инкубацияланган (маалымат үчүн Материалдарды жана методдорду караңыз).Реакция продуктулары SDS-PAGE менен бөлүнгөн жана Coomassie бриллиант көк түскө боёлгон.(B) Radiolabeled белок phosphorous сүрөттөө аркылуу көрүүгө болот.Nsp12-His6 жана белоктун молекулалык массасынын маркерлеринин позициялары (килодалтондордо) А жана Вде көрсөтүлгөн. (C) Радиоактивдүү сигналдын интенсивдүүлүгү (орточо ± SEM) үч көз карандысыз эксперименттен аныкталган.*P≤0,05.Сигналдын күчү (пайыз) UTP менен байланыштуу.
NiRAN менен байланышкан ферменттердин активдүүлүгү клетка маданиятында EAV жана SARS-CoV репликациясы үчүн маанилүү экени далилденгени менен (16), NiRANдын өзгөчө функциясы жана потенциалдуу максаттары азырынча аныктала элек.NiRAN менен протеинкиназа сымал бүктөлүшү бар белоктордун үй-бүлөсүнүн ортосундагы жакында билдирилген структуралык окшоштук (17, 22) бизди NiRAN башка белоктордун NMPylation катализдейт деген гипотезаны сынап көрүүгө түрткү берди.Биз HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) тарабынан коддолгон структуралык эмес протеиндерди камтыган потенциалдуу гомологдук максаттардын топтомун түздүк, ар биринде C-терминал His6 теги бар (SI тиркеме, Таблица S1) жана бул протеиндерди nsp12 бар же жок болгон учурда [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) менен инкубациялаңыз.E. coliде өндүрүлгөн бодо малдын сывороткасындагы альбумин жана MBP-LacZα синтез протеин башкаруучу катары кызмат кылган (Figure 2A, 1-7-сызыктар).Радиобелгиленген белок натрий додецилсульфаты-полиакриламиддик гель электрофорези (SDS-PAGE) жана авторрадиография жолу менен анализденди жана nsp12 жана nsp9 камтыган реакцияда күчтүү радиоактивдүү сигнал бар экени аныкталды.Сигналдын абалы nsp9дун nsp12 ортомчу UMPylation көрсөтүүчү молекулалык массасына туура келет (сүрөт 2B, трек 7).Башка эч кандай сыноо протеиндери UMPylated деп табылган жок, бул бизди nsp9 nsp12нин өзгөчө субстраты деген тыянакка алып келди.1-сүрөттө көрсөтүлгөн өзүн-өзү NMPylation маалыматтарына ылайык, nsp12 бардык төрт NMPти nsp9га өткөрө алат, бирок натыйжалуулугу ар башка, UMP> аденозин монофосфат (AMP)> гуанозин монофосфат (GMP)> цитидин монофосфат (CMP) ) ( Сүрөт).3 А жана Б).Бул анализде колдонулган шарттарда (реакция жана экспозиция убактысын кыскартуу, nsp12 концентрациясын азайтуу; материалдар жана методдор) nsp12нин өз алдынча NMPylation аныктоо мүмкүн эмес (сүрөт 2B, тилке 7 жана 1B сүрөтүн салыштырыңыз), бул натыйжалуулугун далилдеди (Жана бир нече раунд) UMP nsp12ден nsp9га жылды.UMP трансфераза активдүүлүгү Mn2+ иондорунун болушун талап кылат, 3C сүрөттө көрсөтүлгөндөй, ал эми Mg2+ катышканда минималдуу UMP трансфераза активдүүлүгү байкалган, ал эми башка эки эки валенттүү катиондун катышуусунда активдүүлүк байкалган эмес.Окшош маалыматтар цитидин трифосфат (CTP), гуанозин трифосфат (GTP) жана аденозин трифосфат (ATP) камтыган NMPylation анализдеринде алынган (SI тиркемеси, S1 сүрөт).
HCoV-229E nsp12 ортомчу UMPylation of nsp9.HCoV-229E nsp12-His6⁺-медициналык UMPylation активдүүлүгүн баалоо үчүн бир катар белок субстраттары (анын ичинде бодо малдын сары суусу альбумини, MBP-lacZα жана ORF1a тарабынан коддолгон C-терминал His6 менен белгиленген HCoV-229E nsps сериясы) колдонулган. белок.Протеинди [α-32P] UTP менен 10 мүнөткө nsp12 жок (A) же бар (B) материалдарда жана методдордо сүрөттөлгөндөй инкубациялаңыз.А жана В үстүнкү бөлүгүндө Coomassie Brilliant Blue менен боёлгон SDS-полиакриламиддик гель, ал эми А жана В ылдый жагында тиешелүү авторадиограммалар көрсөтүлгөн.Белоктун молекулалык массасынын маркеринин абалы (килодалтондордо) сол жакта берилген.nsp12-His6 (B, үстү) абалы жана nsp12-His6 nsp9-His6 (B, лента 7) менен инкубациялоо учурунда байкалган радиоактивдүү сигнал да көрсөтүлгөн, бул [α-32P]UMP nsp9-His6га чейин экенин көрсөтүп турат. (12,9 кДа), башка протеиндер үчүн байкалган эмес.
HCoV-229E NiRAN аркылуу nsp9 NMPylation биохимиялык жана вирусологиялык мүнөздөмөсү.(А жана В) Реакцияда колдонулган нуклеотиддик ко-субстраттын ролу.Nsp12-His6 жана nsp9-His6 аралашып, стандарттык NMPylation анализинде ар кандай [α-32P] NTPs катышуусунда инкубацияланат.(A, үстү) SDS-PAGE менен бөлүнгөн Coomassie менен боёлгон nsp9-His6.(А, ылдыйда) Гельдин ошол эле аймагынын авторадиографы.(B) Белгиленген нуклеотиддик кофактордун катышуусунда салыштырмалуу активдүүлүк (орточо ± SEM) үч көз карандысыз эксперименттен аныкталат.*P≤0,05.(C) Металл иондорунун ролу.Көрсөтүлгөн стандарттуу NMPylation сыноо [α-32P] UTP жана ар бир концентрациясы 1 мМ болгон ар кандай металл иондорунун катышуусунда.Сда үстү жагында Coomassie боёлгон nsp9-His6, ал эми Сда төмөнкүдө тиешелүү авторадиография көрсөтүлгөн.Белгиленген протеиндин өлчөмү (килодалтондор менен) A жана Cтин сол жагында көрсөтүлгөн. (D) Белгиленген аминокислота алмаштырууну алып жүрүүчү HCoV-229E nsp12-His6 мутанттык формасы сүрөттөлгөндөй [α-32P]UTP ичинде Материалдар жана методдор.NMPylation реакциясында өндүрүлгөн радиобелгиленген nsp9-His6 фосфорлануу сүрөттөө аркылуу аныкталат (D, жогорку).Жапайы типтеги (wt) протеин менен салыштырылган салыштырмалуу активдүүлүк D көрсөтүлөт, ал эми түбү үч Көз карандысыз эксперименттен орточо (±SEM) катары алынат.Жылдызчалар сакталбаган калдыктарды алмаштырууну көрсөтөт.(E) Инфекциядан 24 сааттан кийин алынган p1 клеткаларынын культуралдык супернатантындагы вирус титери бляшка анализи менен аныкталган.Инженердик HCoV-229E мутантынын NiRAN домениндеги кодон алмаштыруулары көрсөтүлгөн (калдыктарды номерлөө алардын pp1ab ичиндеги абалына негизделген).Репликациялоо жетишсиз RdRp активдүү сайт мутанты nsp12_DD4823/4AA башкаруу катары колдонулган.
NiRAN активдүү сайтын тереңирээк түшүнүү жана nsp9-спецификалык NMP трансферазасынын активдүүлүгүнө байланыштуу калдыктарды аныктоо үчүн, биз мутация анализин жүргүздүк, анда биз NiRAN AN, BN жана CN мотивдериндеги консервативдик калдыктарды алмаштырдык ( 16) Бул Ала (SI тиркемеси, S2 сүрөт).Мындан тышкары, консервативдик Arg-to-Lys же Lys-to-Arg алмаштыруунун таасири эки учурда бааланган.(терс) башкаруу катары, NiRAN доменинде сакталбаган же азыраак сакталган калдыктар Ala менен алмаштырылат коронавирустардын жана башка уя салынган вирустардын ордуна. K4116A (preAN мотивинде), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив) BN) жана D4280A (CN) nsp12 аркылуу nsp9 NMPylation бир кыйла азайтат же жок кылат, ал эми консервативдик алмаштыруучу белоктор (R4178K), K4116R) активдүүлүгүнүн 60% жана 80%ын сактап калышат, бул алардын тиешелүү тарабында чектөөлөрдүн жеңилдешин көрсөтөт. чынжырлар физикалык-химиялык жактан сезгич (3D-сүрөт).Бир нече башка сакталган калдыктарды алмаштыруу E4145A, D4273A, F4281A жана D4283A алда канча азыраак зыяндуу жана nsp9 UMPylation бир аз гана азаят.Окшош натыйжалар nsp9 NMPylation реакцияларында башка NTPs (Figure 3D жана SI Тиркеме, Figure S3) алынган, белгилүү бир аминокислота алмаштыруучу байкалган таасирлер колдонулган нуклеотиддик ко-субстраттын түрүнө көз каранды эмес экендигин тастыктайт.Андан кийин, биз бул nsp12 алмаштыруунун коронавирустун клетка маданиятындагы репликациясына тийгизген таасирин сынап көрдүк.Бул максатта, биз 5-7 клетканы транскрипциялоо үчүн рекомбинанттык vaccinia вирусунда (23, 24) клондолгон ылайыктуу гендик инженерияланган комплементарлык ДНК (cDNA) шаблондорун колдондук.Бул клеткаларда өндүрүлгөн жугуштуу вирустун тукумун титрлөө HCoV-229E NiRAN мутанттарынын көпчүлүгүн ишке ашыруу мүмкүн эмес экенин көрсөттү (3E-сүрөт).Жашоого жөндөмдүү эмес вирустук мутанттардын тобуна NMP трансфераза активдүүлүгүн жок кылуу же олуттуу төмөндөтүү үчүн көрсөтүлгөн альтернативалар кирет (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), бирок дагы эки альтернатива бар (K4116R, E4105A) % сакталдыбы?Алардын in vitro NMPylation иш кошумча чектөөлөр тартылган экенин көрсөтүп турат.Ошо сыяктуу эле, NiRANдын in vitro NMPylation активдүүлүгүнүн орточо төмөндөшүнө алып келген башка эки мутация (R4178K, F4281A) тирүү вирустарды пайда кылган, бирок бул вирустар репликация аркылуу титрлерди бир топ кыскарткан.3D-сүрөттө көрсөтүлгөн in vitro активдүүлүгүнүн маалыматтарына ылайык, коронавируста жана/же башка уя салынган вирустарда (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) сакталбаган төрт башка калдыктарды алмаштыруу (8, 16) жапайы типтеги вируска салыштырмалуу бир аз кыскарган титр (Figure 3E).
NiRAN ортомчулук кылган NMP трансфераза активдүүлүгү активдүү RdRp доменинен көз каранды экендигин изилдөө үчүн RdRp мотивинде C эки валенттүү металл иондорунун (11) координациясына катышкан эки консерваланган Asp калдыктары Ала менен алмаштырылган. Натыйжада nsp12_DD4823/4AA протеин сактайт. анын nsp9 NMPylation активдүүлүгү, бул nsp12-арачыланган in vitro nsp9 NMPylation активдүүлүгү полимераз активдүүлүгүн талап кылбайт (SI Тиркеме, S4 сүрөт).
nsp12 үчүн nsp9-спецификалык NMP трансфераза активдүүлүгүн орноткондон кийин, биз NMP-nsp9 кошумчасын масс-спектрометрия (MS) менен мүнөздөөгө аракет кылдык.HCoV-229E nsp9 рекомбинаттын толук протеин массасынын спектри 12,045 Да чокусун көрсөттү (сүрөт 4A).nsp12 кошулуусу nsp9 сапатын өзгөртпөйт, бул nsp12 жана nsp9 колдонулган шарттарда туруктуу комплекс түзбөй турганын көрсөтүп турат (денатурация) (4А-сүрөт).UTP жана GTP болгон учурда, nsp9 жана nsp12 камтыган реакциянын массасын өлчөө, UTP протеининин массасы 306 Да, ал эми GTPдин белок массасы 345 Да жылганын көрсөттү, бул ар бир nsp9 молекуласы UMP же GMP менен байланыштырат. (4-сүрөт) C жана D).Бул NiRAN ортомчу nsp9 NMPylation үчүн зарыл болгон энергия NTP гидролиз жана пирофосфат чыгаруу келип чыгат деп болжолдонууда.Бул реакцияда nsp9 (максат) nsp12ге (ферментке) караганда 10 эсе молярдык ашыкча колдонулганына карабастан, nsp9дун дээрлик толук NMPylation байкалган, бул nsp12 менен nsp9 ортосундагы өз ара аракеттенүү кыска мөөнөттүү экенин жана nsp12 көбүрөөк nsp9 NMPилдей алат. in vitro молекуласы.
nsp12 жана UTP же GTP катышуусунда nsp9 бир NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI тиркемеси, S1 таблицасы) (AD) нин деконволюцияланган толук протеин массасынын спектри көрсөтүлгөн.(A) nsp9 жалгыз, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP катышуусунда, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP катышуусунда.
NSP9 калдыктарын аныктоо үчүн nsp12 менен UMPylated, nsp9-UMP трипсин менен кесилген.Алынган пептиддер нано-жогорку натыйжалуу суюк хроматография (HPLC) менен бөлүнгөн жана тандемдик масс-спектрометрия (MS/MS) онлайн режиминде анализденген.Byonic программалык пакетин (Протеин метрикасын) колдонуу менен маалыматтарды талдоо N-терминал аминокислотасынын UMPylation көрсөттү.Бул кол менен тастыкталат.[UMP]NNEIMPGK прекурсордук пептидинин тандемдик массалык спектри (SI тиркемеси, S5A сүрөтү) 421 м/z ылдамдыкта фрагментти ачып, UMP nsp9дын 1 калдыгы менен байланыштырат.
Nsp9 N-терминусунда Asn Orthocoronavirinae мүчөлөрүнүн арасында сакталат (SI тиркемеси, S6 сүрөт).Биз N-терминалдагы негизги амин азоту UMP үчүн эң ыктымалдуу акцептор деп эсептесек да, биз N-терминалда NMP байланышынын кошумча далилин алууну чечтик.Ушул себептен улам, HPLC тарабынан тазаланган NMPylated жана NMPylated N-терминалдык пептид nsp9 ацетон жана натрий цианоборогидридинин катышуусунда алынган.Мындай шарттарда пропил (25) менен эркин биринчилик аминдер гана модификацияланышы мүмкүн.NNEIMPGK ырааттуулугу бар N-терминал nsp9-туунду пептидинде эки негизги амин бар, бири Asn N-терминусунда, экинчиси С-терминуста Lys каптал чынжырында.Ошондуктан, пропил топтору эки учуна да киргизилиши мүмкүн.NMPилденбеген пептиддердин алынган ион хроматограммалары SI тиркемесинде, S5B сүрөтүндө көрсөтүлгөн.Күтүлгөндөй, N-терминал жана C-терминал (моно) пропиляцияланган (SI тиркеме, S5B сүрөтү, жогорку тилке) жана дипропиляцияланган пептиддер (SI тиркеме, S5B сүрөтү, төмөнкү тилке) аныкталышы мүмкүн.Бул үлгү nsp9 NMPylated N-терминалдык пептидди колдонуу менен өзгөрөт.Бул учурда, C-терминалдык пропиляцияланган пептиддерди гана идентификациялоого болот, бирок N-терминалдык пропиляцияланган пептиддер жана дипропилденген пептиддер аныкталган эмес (SI Тиркеме, S5C сүрөтү), бул UMP N-терминалдагы негизги аминге которулганын көрсөтөт Мунун алдын алуу үчүн өзгөртүү киргизүүдөн топ.
Андан кийин, максатка тиешелүү чектөөлөрдү аныктоо үчүн nsp9 N-терминусунда сакталган калдыктарды алмаштырабыз (Ала же Сер менен) же жок кылабыз.NiRAN nsp9 N-терминал калдыгынын негизги амини менен nsp9-NMP кошулмасын түзөрүн көрсөткөн биздин MS маалыматтарына таянып, биз nsp9 NMPylation nsp9 N-терминалынан бошотуу үчүн вирустук башкы протеазаны (Mpro, nsp5) талап кылат деп гипотеза жасадык. анын полипротеиндик прекурсору.Бул гипотезаны текшерүү үчүн, биз E. coli ичинде nsp9 камтыган nsp7-11 прекурсордук протеинди өндүрдүк жана [α-32P] UTP (материалдар жана ыкмалар) катышуусунда стандарттуу NMPylation тестин жүргүздүк.5А-сүрөттө (3-жол) көрсөтүлгөндөй, кесилбеген nsp7-11 прекурсору nsp12 менен радиобелгиленген эмес.Ал эми, эгерде nsp7-11 рекомбинантты nsp5 менен прекурсордон nsp9 (жана башка nsps) бөлүп чыгарса, nsp9 менен миграцияланган радиобелгиленген протеин аныкталат, бул биздин NiRAN жана N- Коваленттүү nsp9-NMP кошулмаларынын тандалма түзүлүшү деген тыянагыбызды тастыктайт. .N-терминал Asn терминалдык негизги амини (pp1a/pp1ab жылы 3825 абалы).Бул корутунду N-терминуста бир же эки кошумча калдыктарды камтыган nsp9 конструкциясын колдонуу менен жасалган эксперименттер менен да тастыкталат.Эки учурда тең, nsp9дун NiRAN ортомчулугу менен UMPylation жоюлган (SI Тиркеме, S7 сүрөт).Андан кийин, биз nsp9 N-терминалындагы 3825-NNEIMPK-3832 пептиддик ырааттуулугунан жок кылынган бир же эки Asn калдыктары бар протеинди өндүрдүк.Эки учурда тең nsp9 UMPylation толугу менен бөгөттөлгөн (Figure 5B), чыныгы nsp9 N-терминусу NMP кабылдагыч катары иштээрин кошумча далилдейт.
NSP9 протеолитикалык кайра иштетүү жана N-терминалдык калдыктардын ролу nsp12 ортомчу UMPylation.(A) nsp9 UMPylation акысыз nsp9 N-терминалын талап кылат.Nsp7-11-His6 рекомбинантты Mpro (nsp5-His6) бар же жок болгон учурда UTP камтыган NMPylation аныктоо буферинде 30 °C алдын ала инкубацияланат.3 сааттан кийин, Материалдар жана методдордо сүрөттөлгөндөй nsp12-His6 кошуу менен NMPylation анализин баштаңыз.Башкаруу катары nsp5-His6 (1-лента) жана nsp9-His6 (2-лента) камтыган реакция колдонулган.10 мүнөттөн кийин реакция токтотулду жана реакция аралашмасы SDS-PAGE менен бөлүнгөн.Белок Coomassie Brilliant Blue (А, үстү) менен боёлгон.Nsp7-11-His6 прекурсору жана nsp5-His6 ортомчу бөлүнүүсүнөн келип чыккан иштетилген продукт оң жакта көрсөтүлгөн.Көңүл буруңуз (алардын кичине өлчөмүнөн улам) nsp7 жана nsp11-His6 бул гелде аныкталбайт жана реакция nsp5-His6 менен толукталат (1 жана 4 тилкелер; nsp5-His6 абалы катуу тегерек менен көрсөтүлгөн) же nsp9-His6 (Lane 2) MBP бир аз санда (ачык тегерекчелер менен көрсөтүлгөн) калдыгы аралашмаларды камтыйт, анткени алар MBP синтез протеиндери катары көрсөтүлөт (SI тиркеме, S1 таблица).(B) Nsp9-His6 вариантында бир же эки N-терминалдык Asn калдыктары жок (п1а/pp1ab позициясына ылайык калдык номерлөө) жана тазаланып, nsp12-His6 жана [α-32P] UTP менен инкубацияланат.B, Coomassie менен боёлгон SDS-PAGE жогоруда көрсөтүлгөн, B, ылдый жагында тиешелүү авторадиограф көрсөтүлгөн.Молекулярдык салмак маркеринин абалы (килодалтондордо) сол жакта көрсөтүлгөн.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-терминалында сакталган калдыктар Ala же Ser менен алмаштырылган жана nsp12-His6 ортомчулугу менен UMPylation реакциясында бирдей өлчөмдөгү протеин колдонулган.Реакция продуктулары SDS-PAGE менен бөлүнгөн жана Coomassie Brilliant Blue (C, үстүнкү) менен боёлгон жана радиобелгиленген nsp9-His6 фосфоресценциялык сүрөттөө аркылуу аныкталган (C, орто).Жапайы типтеги (wt) протеинди шилтеме катары колдонуу (100%га коюлган), салыштырмалуу NMPylation активдүүлүгү (орточо ± SEM) үч көз карандысыз эксперименттен эсептелген.(D) HCoV-229E жапайы типтеги Huh-7 клеткалары менен инфекцияланган Huh-7 клеткаларынын p1 клетка маданиятынын супернатантындагы вирус титрлери жана nsp9да белгиленген аминокислота алмаштыруучу мутанттар бляшка анализи менен аныкталган.Репликациянын жетишсиздиги бар RdRp мотиви C кош мутант DD4823/4AA терс башкаруу катары колдонулган.
Nsp9 N-терминусу (айрыкча 1, 2, 3 жана 6 позициялары) Orthocoronavirinae субфамилиясынын мүчөлөрүнүн арасында абдан сакталган (SI тиркеме, S6 сүрөт).Бул калдыктардын nsp12 ортомчу nsp9 NMPylationдеги мүмкүн болгон ролун изилдөө үчүн, nsp9 N-терминуста эки ырааттуу Asn калдыктары Ала же Сер менен алмаштырылган (жалгыз же айкалышкан).Жапайы типтеги nsp9 менен салыштырганда, N3825ти Ала же Сер менен алмаштыруу nsp12 ортомчулугу менен иштеген UMPylation эки эседен ашык кыскарган (сүрөт 5C).NMPylation N-терминалдык калдыктын каптал чынжырынын ордуна N-терминалдык негизги аминде болот деген тыянакыбызга ылайык, биз N3825A жана N3825S алмаштыруу менен олуттуу калдык NMPylation байкадык.Кызыктуусу, эгерде экинчи Asn Ала же Сер менен алмаштырылса, nsp9 UMPylation күчтүүрөөк кыскарат (10 эседен ашык), ал эми 3, 4 жана 6-позициялардагы Ала алмаштыруу nsp9 UMPylation боюнча орточо гана таасир этет (2-сүрөт) ).5C).Окшош натыйжалар ATP, CTP же GTP аркылуу алынган (SI тиркемеси, S8 сүрөт).Жалпысынан, бул маалыматтар nsp9 NMPylation N2826 негизги ролун көрсөтүп турат (nsp9 2-позиция).
Nsp9 N-терминусу менен NMPylation ортосундагы функционалдык корреляциянын кошумча далилин алуу үчүн, биз Coronavirus үй-бүлөсүнүн nsp9 ырааттуулугун (104 жана 113 калдыктарынын ортосунда өзгөрөт) бир нече ырааттуу тегиздөө (MSA) аткардык (SI Тиркеме, Сүрөт S6).Бардыгы болуп, ар кандай сүт эмүүчүлөр, канаттуулар жана сойлоп жүрүүчүлөрдүн ээлерин жуктурган Orthocoronavirinae субфамилиясынын 5 тукумунун 47 (белгилүү жана болжолдуу) түрүнүн бардыгында 8 гана калдык инвариант деп табылган.Эң кеңири өзгөрүүлөр, анын ичинде өчүрүүлөр жана киргизүүлөр, мурунку структуралык изилдөөлөр тарабынан аныкталгандай, nsp9нун экинчилик структурасынын элементтеринин ортосундагы циклдерде байкалган (26 ??28).nsp9дун C-терминалдык бөлүгүнүн β тилкесинде жана α спиралында беш инварианттык калдыктар табылган.Үч инварианттык калдык nsp9 N терминалынын NNE мотивин түзөт.Бул мотивдин экинчи Asn бирден-бир инварианттык калдык экени аныкталды, ал ошондой эле алыскы тектеш бака коронавирусунун гипотетикалык nsp9 менен бөлүштүрүлөт жана Alphaletovirus'тун Letovirinae субфамилиясындагы Microhyla letovirus 1 түрүн билдирет.nsp9 экинчи структурасынын элементтеринде калдыктардын сакталышы бүктөлүүчү же белгилүү РНК байланыш касиеттерин сактоо үчүн структуралык ойлор менен рационализацияланышы мүмкүн.Бирок, бул ой жүгүртүү NNEнин сакталышына тиешелүү эмес окшойт жана бул изилдөөгө чейин трипептиддердин ырааттуулугунун вариациясын чектеген чектөөлөрдүн табияты толугу менен көмүскө болгон.
Коронавирустун репликациясында nsp9-NMPylation жана NNE консервациясынын маанилүүлүгүн аныктоо үчүн биз HCoV-229E мутанттарын чыгардык, алар nsp9 N-терминалдык калдыктарынын бир же кош алмаштыруусун алып жүрүшөт, бул nsp9 NMPylation in vitro зыяндуу экенин көрсөтүп турат.Баштоодон мурун, биз бул алмаштыруулар (nsp8 | 9 бөлүү сайтына жакын) C-терминал pp1a аймагынын протеолиттик кайра иштетүүсүнө таасир этеби деген суроого жооп берүүгө аракет кылабыз.Nsp9 N-терминусунда тиешелүү алмаштырууларды камтыган nsp7-11 полипротеиндик конструкциялардын жыйындысы E. coliде өндүрүлгөн жана рекомбинантты Mpro менен кесилген.Төрт участоктун (анын ичинде nsp9 каптал жеринин) протеолитикалык бөлүнүүсүнө Mpro ортомчулугу менен nsp8|9 бөлүнүшүнө тоскоол болгон бул белоктордогу структуралык өзгөрүүлөрдү эске албаганда, эч кандай киргизилген алмаштыруулар (SI тиркемеси, S9 сүрөт) олуттуу таасир этпейт (Же башка) веб-сайт.
Huh-7 клеткалары nsp9 N терминалында консервацияланган NNE трипептиддеринде (N3825, N3826 жана E3827) Ала же Ser алмаштырууларды коддоочу геномдук узундуктагы HCoV-229E РНКсы менен трансфекцияланган, бул мутациялардын көбү өлүмгө алып барарын көрсөткөн.Биз N-терминал Asn (N2835A же N2835S) Сер же Ала алмаштыруу аркылуу вирусту куткара алдык, бирок вирусту NNE ырааттуулугундагы башка бир жана кош мутациялар менен калыбына келтире алган жокпуз (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (5D-сүрөт).
Бул натыйжалар ткань маданиятында коронавирустардын репликациясынын чектелгендигин (бирдей же окшош) көрсөтүп турат, организмдеги nsp9 NMPylation сайттарынын табигый мутациясын чектейт жана коронавирустун жашоо циклинде бул жооптун негизги ролун колдойт.
Эксперименттердин акыркы топтомунда SARS-CoV-2 nsp12 жана nsp9 деп белгиленген His6 C-терминалын жана E. coliде nsp12нин эки мутанттык формасын чыгардык.NiRAN жана RdRp домендериндеги активдүү сайт калдыктары тиешелүүлүгүнө жараша Use Ala болгон (Figure 6A жана SI тиркемеси, Таблица S2).SARS-CoV-2 nsp12деги K4465 HCoV-229Eдеги K4135ке туура келет (SI Тиркеме, S2 сүрөт), ал NiRAN активдүүлүгү жана HCoV-229E репликациясы үчүн талап кылынган (3D жана E сүрөт).Бул калдык ошондой эле EAV nsp9 K94 артериялык вирусунун калдыгына туура келет, ал мурда NiRAN өз алдынча UMPylation/self-GMPylation (16) үчүн зарыл болгон.6B-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, SARS-CoV-2 nsp12 субстрат катары nsp9 колдонуп UMP трансфераза активдүүлүгүнө ээ, ал эми nsp12_K4465A активдүү сайт мутанты жигердүү эмес.RdRp мотивинин С SDD мүнөздүү ырааттуулугундагы кош алмаштыруу UMP трансфераза активдүүлүгүнө таасир этпейт (6B-сүрөт), бул RdRp активдүүлүгү nsp9 UMPylation түз таасирин тийгизбейт.Окшош маалыматтар CTP, GTP жана ATP аркылуу алынган (SI тиркемеси, S10 сүрөт).Жыйынтыктап айтканда, бул маалыматтар NiRAN ортомчулугу менен nsp9 NMPylation ортокоронавирус субфамилиясынын ар кандай тукумун билдирген коронавирустарда консервативдүү активдүүлүккө ээ экендигин көрсөтүп турат.
SARS-CoV-2 nsp12 ортомчу NMPylation NSP9.(A) Coomassie боёлгон SDS-полиакриламиддик гел NMPylation сыноодо колдонулган рекомбинантты протеинди көрсөтүү.Контрол катары, SARS-CoV-2 nsp12нин NiRAN доменинде (K4465A) жана RdRp доменинде (DD5152/3AA) активдүү сайтты алмаштыруучу мутант протеин колдонулган.Калдыктарды номерлөө pp1ab ичиндеги абалга негизделген.(B) nsp12-His6 субстраты катары nsp9-His6 жана [α-32P]UTP колдонуу менен UMPylation аныктоонун Autoradiograph (жапайы түрү [wt] жана мутант).Белгиленген белоктун молекулалык массасы (килодалтондор менен) сол жакта көрсөтүлгөн.
NiRAN домендери көбүнчө Нидовиралесте (16) сакталат, бул алар Nidovirus репликациясы үчүн зарыл болгон ферменттик реакцияларды катализдештирет.Бул изилдөөдө биз коронавирустун NiRAN домени NMPди (NTPден түзүлгөн) nsp9га, вирустун репликациясына катышкан сырдуу РНКны байланыштырган протеинге (26 ?? 29) өткөрүп берерин далилдей алдык, аны табигый максат катары аныктоо жана coronavirus RTC өнөктөшү.
NiRAN домени үч ырааттуу мотивди (AN, BN жана CN) бөлүшөт, алар монофилетикалык, бирок өтө дифференцияланган Nidovirales тартибинде бардык үй-бүлөлөрдө сакталган өтө аз сандагы калдыктарды камтыйт (8, 16).Акыркы изилдөөлөр алар түзүмдүк жактан алгач SelO үй-бүлөсү (17, 19, 22, 30, 31) деп аталган белок киназа сымал белоктордун негизинен мүнөздөлбөгөн үй-бүлөсүнө байланыштуу экенин көрсөттү.SelO-байланыштуу белоктор киназа бүктөмдөрү бар, бирок классикалык киназаларда бир нече консерваланган активдүү сайт калдыктары жок (22, 32).Активдүү аймакка байланышкан жана спецификалык өз ара аракеттешүү менен турукташкан АТФ молекулаларынын тескери багытынын негизинде, SeO гипотеза жасалып, кийинчерээк AMP (фосфаттын ордуна) белок субстратына (22) өтүшү тастыкталган, ал эми дагы бир бактериялык SelO сымал протеин YdiU бар. Жакында UMPтин Тирге жана анын ар кандай белок субстраттарынын калдыктарына коваленттүү кошулушун катализдөө үчүн көрсөтүлдү (33).
Коронавирустун NiRAN доменинин болжолдуу активдүү сайтынын калдыктарын болжолдоону ырастоо жана кеңейтүү үчүн биз nsp12 коронавирусуна мутация анализин жүргүзүү үчүн биохимиялык жана тескери генетикалык ыкмаларды колдондук (3D жана E жана SI тиркемеси, S3 сүрөт жана таблица) S1â S4).Берилген маалыматтар HCoV-229E K4135, R4178 жана D4280ди Ala менен алмаштыруу NTP γ-фосфатында алардын катышуусун колдогон in vitro NMP трансфераза активдүүлүгүн жана клетка маданиятында вирустун репликациясын жок кылаарын көрсөтөт (3D жана E жана SI тиркемелери, S3-сүрөт). (K4135, R4178) жана активдүү сайт металл иондорун координациялоо (D4280).K4135 (17) позициясын турукташтыруу үчүн болжолдонгон канаттуулардын уясынын вирусунун диапазонундагы E4145A консервацияланган Glu алмаштыруу вирустун репликациясын жок кылганы көрсөтүлгөн, бирок таң калыштуусу, активдүүлүк in vitro NMPylation анализинде сакталып калган (3D жана E сүрөтү жана SI тиркемеси, S3-сүрөт жана S1–S4 таблицалары).Тиешелүү алмаштыруу Salmonella typhimurium (E130A) (33) YdiU гомологуна киргизилгенде ушундай эле байкоо жүргүзүлгөн.Чогуу алганда, бул маалыматтар каталитикалык функцияны эмес, бул сакталган калдыктын жөнгө салуучу функциясын колдойт.
Консервацияланган Phe калдыгын (F4281A) HCoV-229E NiRAN домениндеги (8) нестовирус диапазонунда алмаштыруу in vitro NMPylation активдүүлүгүнүн төмөндөшүнө жана клетка маданиятында вирустун репликациясынын олуттуу төмөндөшүнө алып келди (3D, E жана SI сүрөтү) тиркеме, S3-сүрөт).Маалыматтар бул калдыктын маанилүү жөнгө салуучу функциясына дал келет, мисалы, мурда көрсөтүлгөн гомологдук DFG мотиви Phe калдыгы.Классикалык протеин киназаларында ал Mg2+ байланыштыргыч циклдин бир бөлүгү болуп саналат жана омуртканы чогултууга жана жөнгө салууга жардам берет???Натыйжалуу каталитикалык активдүүлүк үчүн талап кылынат (32, 34).Ала жана Аргды K4116 калдыктары үчүн алмаштыруу (preAN мотивинде) тиешелүүлүгүнө жараша, вирустун репликациясын жок кылды жана күтүлгөндөй, киргизилген аминокислота каптал чынжырына жараша in vitro NMP трансфераза активдүүлүгүнө ар кандай таасир тийгизди (Figure 3D And E жана SI тиркемелери). , Сүрөт S3).Функционалдык маалыматтар структуралык маалымат менен шайкеш келет, бул калдык АТФ фосфаты (17) менен өз ара аракеттенүүнү белгилейт.Башка уя салынган вирус үй-бүлөлөрүнүн NiRAN доменинде HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 позициясын Lys, Arg же His (8) ээлейт, бул бул өзгөчө калдыктын функционалдык чектөөсү жумшартылганын көрсөтүп турат.D4188A жана D4283A алмаштыруу ферменттердин активдүүлүгүн жок кылат же катуу азайтат жана вирустун репликациясын жок кылат (3-сүрөт).Бул эки калдык көпчүлүк (бирок баары эмес) уя салынган вирустарда (8) сакталган, бул үй-бүлөгө тиешелүү, бирок каталитикалык эмес функцияны көрсөтүп турат.Башка бир нече Lys жана Asp калдыктарынын (K4113A, D4180A, D4197A жана D4273A) ала алмаштыруулары, алар Coronaviridae же башка Nestioviridae үй-бүлөлөрүндө (8) сакталган эмес.Күтүлгөндөй, бул алмаштыруулар негизинен чыдамдуу, ферменттердин активдүүлүгүнүн бир аз төмөндөшү жана айрым учурларда вирустун репликациясы (3-сүрөт жана SI тиркемеси, S3-сүрөт).Жалпысынан, коронавирустун мутагенезинин маалыматтары EAV NiRAN-RdRp (16) өздүк GMP жана тескери генетикалык маалыматтарына абдан шайкеш келет, анда EAV nsp9 (коронавирус nsp12 ортологу) K94 калдыгы (HCoV- 229E K4135 туура келет) маанилүү функцияларды аткарат), R124 (R4178ге туура келет), D132 (D4188ге туура келет), D165 (D4280ге туура келет), F166 (F4281ге туура келет).Кошумчалай кетсек, HCoV-229E мутагенезинин маалыматтары SARS-CoV_nsp12 тиешелүү CN мотивинин Phe-to-Ala мутанты үчүн байкалгандай эле, мурда билдирилген SARS-CoV тескери генетикалык маалыматтарга (16) дал келет жана кеңейтилген. фенотип сүрөттөлгөн -F219A жана HCoV-229E_F4281A (Figure 3 D жана E жана SI тиркемеси, Сүрөт S3 жана Таблица S1-S4).
UTP жана GTP (өзүн-өзү NMPylation реакциясында) так артыкчылыкка ээ болгон EAV ортологдору (16) менен салыштырганда, биздин изилдөө NiRAN коронавирус домени (HCoV-229E жана SARS-CoV-2 тарабынан көрсөтүлгөн) натыйжалуу боло аларын көрсөтүп турат. UMP үчүн бир аз артыкчылык бар болсо да, бардык төрт НМП өткөрүлдү (1 жана 3-сүрөттөр).Белгилүү NTP ко-субстратынын салыштырмалуу төмөн өзгөчөлүгү жакында кабарланган SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 суперкомпозиттик структурасына шайкеш келет, анда ADP-Mg2+ NiRANдын активдүү жерине байланышат, бирок аденин бөлүгү менен эмес. спецификалык өз ара аракеттенүүнүн калыптанышы (17).Биздин изилдөөбүздө NMPylation реакциясында колдонулган нуклеотиддердин түрү мутанттык белоктун активдүүлүгүнө дифференциалдык таасир этпейт (SI Тиркеме, S3 сүрөт), бул калдыктардын бири да белгилүү бир нуклеобазанын байланышы менен тыгыз байланышта эместигин көрсөтөт.Коронавирустардын жана артериялык вирустардын NiRAN домендеринде байкалган ар кандай NTP ко-субстраттарынын структуралык негизи жана потенциалдуу биологиялык мааниси изилдөөнү талап кылат;алар туура болушу мүмкүн же алардын тиешелүү изилдөөлөрүнүн чектөөлөрүнөн улам болушу мүмкүн.Азыркы учурда артериялык вирустун NiRAN доменинин потенциалдуу NMPylator активдүүлүгү (мурда мүнөздөлгөн өз алдынча NMPylation активдүүлүгүнө салыштырмалуу) артериалдык жана коронавирустун окшоштугун эске алуу менен башка ко-субстрат артыкчылыкка ээ экендигин жокко чыгарууга болбойт. NiRAN домени анын чегинде.Ырааттуулукка негизделген салыштыруу (16).Кофактор катары Mg2+ колдонгон псевдокиназа SelO менен салыштырганда, коронавирустун жана NiRAN артериялык вирусунун активдүүлүгү Mn2+ көз каранды (16) (3C-сүрөт жана SI тиркемеси, S1-сүрөт).Mn2+ көз карандылыгы жана UTP үчүн ачык артыкчылык NMPylators протеининин адаттан тыш өзгөчөлүгү болуп саналат жана жакында эле Salmonella typhimurium YdiU протеинде тастыкталды, ал клеткаларды стресстин индукциясынан коргоо үчүн Mn2+-каранды белок шаперонунун UMPylation катализдейт. 33).
Коронавирустун NiRAN домени менен клеткалык протеин киназаларынын ортосундагы жакында сүрөттөлгөн структуралык окшоштук (17, 19) NiRANдын NMPти башка белоктор менен коваленттүү байланыштыруу жөндөмүнө кошумча колдоо көрсөтөт.Биз мүмкүн болгон NiRAN буталарын издөөбүздү HCoV-229E ORF1a тарабынан коддолгон протеиндерге багыттадык, алар RTCнун ORF1b-коддолгон репликасына түз же кыйыр түрдө жардам берери белгилүү (12, 35).Биздин эксперименттер nsp9 эффективдүү жана конкреттүү NMPylation үчүн айкын далилдерди берет (2-сүрөт).Эгерде максаттуу белок энзимге (nsp12) караганда 8-10 эсе жогору молярдык ашыкча колдонулса, анда nsp9 толугу менен (моно) NMPлештирилгени тастыкталат (4-сүрөт).Биз nsp12 жана nsp9 ортосундагы өз ара аракеттенүү кыска мөөнөттүү жана nsp9 менен туруктуу комплексти түзбөйт деген жыйынтыкка келдик (башка RTC бөлүмчөлөрү жок болгондо).Бул тыянак SARS-CoV протеомундагы белоктун өз ара аракеттенүүсүн изилдөөлөр менен тастыкталат (35).MS анализи NMP9дын N-терминалдык калдыгынын негизги аминин NMPylation сайты катары аныктады (SI тиркемеси, S5 сүрөт).Фосфорамидаттык байланыштын жана N-терминалдык амин тобунун түзүлүшү NiRAN-арачы болгон NMPylation активдүүлүгүн Pseudomonas syringae SelO ортомчу AMPylation реакциясынан айырмалайт, ал Ser, Thr же Tyr калдыктарында O-байланышкан AMP түзүлүшүн катализдейт. 22), жана S. typhimurium YdiU O-байланышкан (Тир менен) жана N-байланышкан (Ос менен) пептид-UMP кошулмаларын түзөт.Белоктордун SelO үй-бүлөсү боюнча чектелген маалымат бул чоң белок үй-бүлө мүчөлөрү пептиддик-NMP кошулмаларынын пайда болуу жагынан абдан айырмаланарын көрсөтүп турат.Бул кошумча изилдөөгө татыктуу болгон кызыктуу байкоо.
Бул изилдөөдө алынган маалыматтар nsp9 NMPylation эркин N-терминусу талап кылат деген гипотезага алып келди.Вирустук репликациянын контекстинде бул Mpro жана pp1ab ортомчулугу менен репликаланган полипротеин pp1aдагы nsp8|nsp9 иштетүүчү сайттын протеолиттик бөлүнүшү менен камсыз кылынат.Көпчүлүк коронавирустарда бул спецификалык сайттын (HCoV-229Eдеги VKLQ|NNEI) жана башка бардык коронавирус Mpro бөлүктөрүнүн ортосундагы айырма Asn (башка кичинекей калдыктын ордуна, мисалы, Ала, Сер же Гли) P1â ээлейби???Жайгашкан жери (36).Алгачкы изилдөөлөрдө алынган пептиддик бөлүнүү маалыматтары nsp8|nsp9 сайтынын бөлүнүү эффективдүүлүгү башка сайттарга караганда төмөн болгонун көрсөттү, бул 1) бул конкреттүү сайт C-терминалын өз убагында макулдашылган кайра иштетүүдө жөнгө салуучу ролго ээ болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. pp1a аймагы, же 2) a Вирустун репликациясында атайын сакталган nsp9 N-терминусунун ролу (37).Биздин маалыматтар (5А-сүрөт) чыныгы N-терминал ырааттуулугун алып жүрүүчү nsp9 рекомбинанттык формасы nsp12 тарабынан натыйжалуу NMPлештирилгенин көрсөттү.N-терминалдын капталдагы ырааттуулугу Xa фактору (nsp9-His6; SI тиркемеси, S1 таблицасы) же Mpro-арачыланган бөлүнүү (nsp7-11-His6; 5A сүрөтү жана SI тиркемеси, S1 таблицасы) тарабынан алынып салынган.Маанилүү нерсе, кесилбеген nsp9 камтыган прекурсор nsp7-11-His6 nsp12 NMPylation каршылык көрсөттү, бул биздин маалыматтарга шайкеш келет, бул nsp9-NMP кошулмасы N-терминалдык негизги амин аркылуу пайда болгонун көрсөтүп турат (SI тиркемеси, S5 сүрөт) .NiRAN субстратынын өзгөчөлүгүн тереңирээк түшүнүү үчүн, биз андан кийин nsp9дун чектеш N-терминал калдыктарына көңүл бурдук.Башка белоктордун жоктугунан, алар структуралык жактан ийкемдүү болуп, аларды nsp9 (26 28, 38) белгиленбеген түрүндө аныктоого жол бербейт, бул алардын чектелген табигый вариациясын көрсөтүп турат. nsp9 N-терминал фрагментинин функциясы.Бул аймакта консервацияланган калдыктардын ала алмаштыруулары (5C жана D жана SI тиркемесинде, S8-сүрөт) N3826 nsp9 NMPylation in vitro үчүн маанилүү экенин көрсөтүп турат, ал эми N3825A жана E3827A алмаштыруулар NMPилациянын төмөндөшүнө алып келет, ал эми M3829A жана P383 алмаштырылбайт. .Албетте, nsp9 NMPylation таасир этет.N-терминал Asn (N3825A, N3825S) алмаштыруу клетка маданиятында nsp9 NMPylation жана вирустун репликациясына орточо гана таасир этсе да (5C жана D-сүрөт), N-терминал 3825-NN дипептидинен Asn калдыктарынын ырааттуулугун жок кылуу. Бул вирустар үчүн өлүмгө алып келет, бул N-терминуста башка калдыктын алдында бир Asn калдыгы керек экенин көрсөтүп турат, жакшыраак Asn, бирок окшош калдыктарды алмаштырууга жарым-жартылай чыдаса болот (сүрөт 5B, C жана D).Биз 3825-NN дипептиди, өзгөчө коронавирус диапазонунда сакталган жана маанилүү N3826 калдыгы (SI тиркемеси, S6 сүрөт), NiRANдын активдүү сайтында nsp9 N-терминусунун туура байланышын жана багытын камсыздайт деген жыйынтыкка келебиз.
Ala (E3827A) бардык субфамилиялардын консервацияланган Glu үчүн алмаштырылышы nsp9 NMPylation in vitro сактайт, бирок клетка маданиятындагы вирустар үчүн өлүмгө алып келет (5C жана D-сүрөт), бул калдыктын кошумча функциясын көрсөтөт, мисалы, негизги өз ара аракеттенүүдө (NMPylated же өзгөртүлбөгөн) ) nsp9 N-терминусу жана вирустун репликациясына катышкан башка факторлор.Nsp9 мутациялары nsp9 же жанаша турган nsps (39) протеолитикалык процессине таасирин тийгизген жок (SI Тиркеме, S9 сүрөт), бул байкалган бир нече nsp9 мутацияларынын өлүмгө алып келүүчү фенотиптери С протеолитикалык процесс-терминал pp1a аймагынын дисрегуляциясы менен шартталган эмес экенин көрсөтүп турат. .
Жогорудагы маалыматтар pp1a/pp1abдагы nsp8|9 бөлүү участогун Mpro ортомчулугу менен дарылоодон кийин nsp9дун N-терминусун UMPyled (же башка NMP менен жарым-жартылай өзгөртүлүшү) мүмкүн экендигин далилдейт.Мындан тышкары, nsp9 N-терминусунун эң сонун сакталышы (анын ичинде коронавирустун үй-бүлөсүндө сингулярдуу жана инвариант Asn калдыктары) жана бул изилдөөдө алынган тескери генетикалык маалыматтар (3E жана 5D-сүрөттөр) сүрөттөлгөн nsp9 NMPylation деген тыянак чыгарууга алып келди. биологиялык жактан байланыштуу жана коронавирустун репликациясы үчүн зарыл.Бул модификациянын функционалдык кесепеттери, мисалы, мурда сүрөттөлгөн (спецификалык эмес) nsp9 (өзгөрүлгөн форма) РНКны байланыштыруучу активдүүлүк (2628) боюнча изилдениши керек.N-терминалдык NMPylation ошондой эле протеин же РНК субстраттары менен nsp9 өз ара аракеттенүү же ар кандай төрт даражалуу жыйындарды пайда болушу мүмкүн.Булар структуралык изилдөөлөрдө байкалган жана функционалдык түрдө коронавирустун репликациясына байланыштуу экени тастыкталган, бирок өзгөчө бул модификация болгон учурда (26- ââ29, 40).
Коронавирустун NiRAN доменинин максаттуу өзгөчөлүгү дагы эле майда-чүйдөсүнө чейин мүнөздөлүшү керек болсо да, биздин маалыматтар коронавирустун NiRAN доменинин протеиндик максаттуу өзгөчөлүгү өтө тар экенин көрсөтүп турат.Бардык нидовирустардын үй-бүлөлөрүнүн NiRAN доменинде негизги активдүү сайт калдыктарынын (8, 16) сакталышы консервацияланган NMPylator бул протеиндердин активдүүлүгүн бекем колдосо да, бул домендин субстрат менен байланышуучу чөнтөк калдыктарынын идентификациясы сакталышы жана сакталышы мүнөздөлөт. , жана Nidovirales максаттарынын ар кандай үй-бүлөлөрүнүн ортосунда айырмаланышы мүмкүн.Ошо сыяктуу эле, башка уя салынган вирустардын тиешелүү максаттары дагы эле аныктала элек.Алар nsp9 же башка протеиндердин алыскы ортологдору болушу мүмкүн, анткени көбүнчө уя салынган вирустарда сакталган беш реплика доменинен тышкары тизмектер азыраак сакталат (8), анын ичинде Mpro жана NiRAN ортосундагы геномдук массив, Алардын арасында nsp9 жайгашкан. коронавирус.
Мындан тышкары, биз учурда NiRAN доменинин кошумча (анын ичинде уюлдук) максаттарга ээ болуу мүмкүнчүлүгүн жокко чыгара албайбыз.Бул учурда, бул өнүгүп келе жаткан протеин NMPylators (NMPylators) бактериялык гомологдор (30, 31) "мастер жөнгө салуучу" бар окшойт деп айтууга болот?NMP ар кандай клеткалык белокторду алардын ылдыйкы иш-аракеттерин жөнгө салуу же жок кылуу үчүн модуляциялайт, ошону менен клеткалык стресске жооп кайтаруу жана редокс гомеостаз сыяктуу ар кандай биологиялык процесстерде роль ойнойт (22, 33).
Бул изилдөөдө (2 жана 4-сүрөттөр жана SI Тиркемеси, S3 жана S5 фигуралары) биз nsp12 UMP (NMP) бөлүгүн nsp9да бир (консервацияланган) позицияга өткөргөнүн далилдей алдык, ал эми башка протеиндер өзгөртүлгөн эмес. колдонулган шарттарда, жакшы аныкталган (бошоң эмес) субстрат өзгөчөлүгү колдоого алынат.Ушуга ылайык, N-терминал nsp9 NMPylation менен салыштырганда, nsp12'нин өз NMPylation активдүүлүгү өтө төмөн, аны аныктоо авторадиографиянын көбүрөөк убакытты талап кылат жана nsp12 концентрациясынын 10 эсеге көбөйүшү колдонулат.Мындан тышкары, биздин MS анализибиз nsp12 NMPylation үчүн далилдерди бере алган жок, бул NiRAN доменинин өз алдынча NMPylation (эң жакшысы) экинчи даражадагы иш экенин көрсөтүп турат.Бирок, башка изилдөөлөр бактериялык NMPylator өзүн-өзү AMPylation статусу башка белок субстраттарында алардын NMPylation ишин көзөмөлдөй алат алдын ала далилдер менен камсыз экенин белгилей кетүү керек (22, 33).Ошондуктан, EAV nsp9 (16) жана коронавирус nsp12 (бул изилдөө) үчүн билдирилген өзүн-өзү NMPylation иш-аракеттеринин мүмкүн болуучу функционалдык эффекттерин, анын ичинде C-терминал RdRp доменинин бүктөлүшүнө сунушталган шаперонго окшош таасирин изилдөө үчүн көбүрөөк изилдөө керек. 16) ).
Буга чейин нидовиралдык NiRAN доменинин мүмкүн болуучу агымдык функцияларына байланыштуу бир нече гипотезалар каралып келген, анын ичинде РНК лигазасы, РНК капкакты гуанилат трансферазасы жана протеинди түзүүчү активдүүлүк (16), бирок алардын бири дагы жеткиликтүү төмөн агым функциялары менен шайкеш келбейт.Төмөнкү позицияларда алынган маалымат кошумча божомолдорду жасабастан так эле убакыт.Бул изилдөөдө алынган маалыматтар NiRAN домени протеин-индукцияланган РНК синтезинин башталышына катышканына эң туура келет (бирок далилдей албайт).Буга чейин NiRAN доменинин функциясы 5??²-РНКны жабуу же РНК лигация реакцияларына бул жана башка маалыматтарды колдоо таасир этпейт.Ошондуктан, мисалы, NiRANдын активдүү сайты жалпы база катары консервацияланган Aspди камтыйт (Pseudomonas syringae SelOдагы D252; HCoV-229E pp1abдагы D4271; SARS-CoV-2 nsp12деги D208) (SI Тиркеме, 2-сүрөт) ).S2) (17, 22, 33), ал эми АТФ-каранды РНК лигазасында жана РНК каптоочу ферментте катализ коваленттик фермент-(лизил-N)-NMP аралык заты тарабынан ишке ашырылат, ал Өзгөрбөгөн Lys калдыгын камтыйт ( 41).Кошумчалай кетсек, консервацияланган протеин максаттары үчүн NiRAN коронавирусунун ырааттуулугуна негизделген өзгөчөлүгү жана NTP ко-субстраттары үчүн жумшартылган өзгөчөлүгү (UTPди жактырат) NiRAN ортомчу каптоочу ферментке же РНК лигазага окшош функцияларга каршы турат.
Албетте, текшерүү жана далилденсе, протеин менен шартталган РНК синтезиндеги nsp9-UMP (nsp9-NMP) мүмкүн болгон ролун иштеп чыгуу үчүн көп кошумча жумуш талап кылынат, ал бир нече кызыктуу, бирок (азырынча) мурда билдирилген отчетторду бириктирет. .Бөлүнгөн байкоолор.Мисалы, коронавирустун терс тилкелүү РНКсынын аягы олиго(U) тилкеси менен башталары аныкталган (42, 43).Бул байкоо терс тилкелүү РНКнын синтези nsp9дун UMPyled формасын поли(А) куйругу менен (триггерлер) байланыштыруу менен башталат деген идеяга шайкеш келет (триггерлер), бул РНКны байланыштыруу менен шартталган активдүүлүк жана/же өз ара аракеттенүү башка RTC белок.nsp9 тарабынан берилген UMP бөлүгү андан кийин геномдук РНКдагы 3?²-поли(A) куйругун же башка олиго (A) камтыган ырааттуулукту колдонуу менен nsp7/8/nsp12-арачыланган олигуридилдөө үчүн "праймер" катары колдонулушу мүмкүн. пикорнавирус VPg белок үчүн түзүлгөн механизмге окшош калып катары кызмат кылат (44).Эгер сунуш "нормативдик эмес" болсочу????(Белок менен индукцияланган) терс тилкелүү РНК синтезинин башталышы байкоолорго шилтемени камсыздайт, бул коронавирустун терс тилкелүү РНКсынын аягында UMP (UTPдин ордуна) бар экенин көрсөтүп турат (42), бул нуклеиндик кислота Dicer белгисиз уридин-спецификалык эндонуклеаза менен фосфорланган аягы үзүлөт.Эгер ырасталса, бул нуклеин кислотасынын гидролитикалык активдүүлүгү жаңы пайда болгон терс жиптин 5 ² учунан nsp9дун олигомердик UMPyled түрүн чыгарууга жардам берет.Протеинди даярдоодо nsp9дун мүмкүн болгон ролу мурунку тескери генетикалык изилдөөлөргө да шайкеш келет, алар nsp9 (жана nsp8) коронавирус геномунун 3-учуна жакын сакталган cis-активдүү РНК элементи менен критикалык жана өзгөчө өз ара аракеттенишээрин көрсөттү.45).Бул отчетко ылайык, бул мурунку байкоолор эми кайра каралып, андан аркы изилдөөлөр аркылуу кеңейтилиши мүмкүн.
Кыскача айтканда, биздин маалыматтар N-терминуста RdRp менен байланышкан проприетардык уяланган вирус энзим тегинин өзгөчө активдүүлүгүн аныктады.Коронавируста бул жаңы ачылган NiRAN ортомчу UMPylator/NMPylator активдүүлүгү Mn2+ жана ага чектеш Asn калдыктарына таянуу үчүн колдонулат жана N-терминалдын негизги амини менен (төмөн энергиялуу) фосфорамидаттык байланыштарды пайда кылуу үчүн колдонулат.NSP8 | 9 бөлүү сайтында Mpro ортомчулугу менен бөлүнүү аркылуу nsp9 максаттуу NMPylation үчүн колдонулушу мүмкүн, бул протеаза менен RdRpге чейин созулган NiRAN доменинин ортосундагы функционалдык байланышты көрсөтүп турат.nsp12 NiRAN активдүү сайтында жана nsp9 бутасында негизги калдыктардын сакталышы, эки коронавирустан алынган маалыматтар менен бирге SARS-CoV-2, nsp9 NMPylation бир коронавирус экендигине күчтүү далилдерди берет Консервативдик өзгөчөлүктөр да вирустун репликациясынын негизги кадамы болуп саналат.Колдо болгон маалыматтар бизди протеин менен шартталган РНК синтезиндеги NMP9 формасынын өзгөчө ролу коронавирус жана башка уя салынган вирустар үчүн акылга сыярлык сценарий болуп саналат жана NiRAN дагы башка белгисиз белокторду бутага алышы мүмкүн деген тыянакка алып келет.Вирусту жөнгө салыңыз.Хосттун өз ара аракеттенүүсү.Эгер тастыкталса, протеиндик праймерлердин вирустук РНК синтезине катышуусу мурда аныкталган коронавирус менен пикорнавируска окшош супергруппанын (9) ортосундагы Mpro/3CLpro жана RdRp домендеринин ырааттуу жакындыгын жогорулатат, алар азыр жакында түзүлгөн Писонивириттерде бириккен (9). 46) категориясында.
Биздин маалыматтар ошондой эле бул изилдөөдө аныкталган негизги, тандалма жана консервативдик ферменттик активдүүлүктөр антивирустук дарылар үчүн максат катары колдонулушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.Консервацияланган nsp9 N-терминусунун NiRANдын активдүү жеринде туташуусуна (жана андан кийинки модификациясына) тоскоол болгон кошулмалар ар кандай (суб) тукумдагы инфекциялардан жаныбарлардын жана адамдын коронавирустарын дарылоо үчүн ылайыктуу эффективдүү жана көп тараптуу вируска каршы дарыларга түзүлүшү мүмкүн. Анын ичинде SARS-CoV-2 жана Жакынкы Чыгыш респиратордук синдрому Coronavirus.
Бул изилдөөдө өндүрүлгөн коронавирус протеининин коддоо ырааттуулугу RT-PCR аркылуу HCoV-229E менен жуккан Huh-7 же SARS-CoV-2 менен инфекцияланган Vero E6 изоляцияланган РНКны колдонуу менен күчөтүлгөн жана стандарттуу клондоо процедуралары аркылуу киргизилген.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) же pASK3-Ub-CHis6 (47) экспрессия вектору (SI Тиркеме, S1 жана S2 таблицалары).Жалгыз кодон алмаштыруу ПЦР негизинде сайтка багытталган мутагенез (48) менен киргизилген.MBP синтез протеин өндүрүү үчүн, E. coli TB1 клеткалары тиешелүү pMAL-c2 плазмиддик түзүлүшү менен өзгөртүлгөн (SI тиркеме, стол S1).Бириккен протеин амилоза жакындык хроматографиясы аркылуу тазаланган жана Xa фактору менен бөлүнгөн.Кийинчерээк, C-терминал His6-белгиленген белок, мурда сүрөттөлгөндөй Ni-immobilized металл жакындык хроматографиясы (Ni-IMAC) менен тазаланган (49).Ubiquitin синтез протеин өндүрүү үчүн, E. coli TB1 клеткалары тиешелүү pASK3-Ub-CHis6 плазмиддик түзүлүшүн (SI Тиркеме, Таблица S1 жана S2) жана pCGI плазмиддик ДНК коддоо ubiquitin-айкын C-терминал гидролаза 1 (Ubp1) колдонгон.Трансформация (47).C-терминал His6 теги коронавирустук протеин мурда сүрөттөлгөндөй тазаланган (50).
HCoV-229E nsp12-His6 өз алдынча NMPylation сыноо EAV nsp9 (16) сүрөттөлгөндөй аткарылган.Кыскача айтканда, nsp12-His6 (0,5 µM) курамында 50 mM 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфон кислотасы (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 mM дитиотреитол (DTT), 6 mM MnCl2, µMffe2 көрсөтүлгөн NTP жана 0,17 μM дал келген [α32-P]NTP (3,000 Ci/ммоль; Hartmann Analytic) 30 °Cде 30 мүнөт.nsp12 ортомчу nsp9 NMPylation бардык башка (стандарттуу) NMPylation анализдеринде реакция шарттары төмөнкүдөй жөнгө салынат: nsp12-His6 (0,05 µM) жана nsp9-His6 (4 µM) 50 мМ HEPES-KOH (pH 80) катышуусунда. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 μM NTP көрсөттү жана 0,17 μM дал келген [α32-P]NTP.30°Cде 10 мүнөт инкубациялоодон кийин реакция үлгүсү SDS-PAGE үлгү буфери менен аралаштырылды: 62,5 mM tris(hydroxymetyl)aminometan HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, 2,5% SDS, 10% глицерин жана 0,05% бромофеол көк.Белок 90 °C температурада 5 мүнөт ысытуу менен денатурацияланган жана 12% SDS-PAGE менен бөлүнгөн.Гель бекитилет жана Coomassie Brilliant Blue эритмеси (40% метанол, 10% уксус кислотасы, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250) менен боёлот жана түссүздүрүлөт жана 20 саат бою фосфоресценттүү сүрөт экранында кармалат (NMP дан nsp12 аныктоо үчүн) же (максималдуу) 2 саат (nsp9 NMPylation баалоо үчүн).Экранды сканерлөө үчүн Typhoon 9200 сүрөтчүсү (GE Healthcare) жана сигналдын интенсивдүүлүгүн талдоо үчүн ImageJ колдонулган.
MS анализи үчүн 1 μM nsp12-His6 жана 10 μM nsp9 (гексахистидин теги жок) NMPylation талдоосунда колдонулган (SI тиркеме, Таблица S1) жана 500 μM UTP жана GTP көбөйгөн концентрациясы колдонулган.Алардын концентрациясына жана күтүлгөн протеиндин сапатына жараша, MassPrep тилкеси (Суулар) менен жабдылган Waters ACQUITY H-Class HPLC системасы буфердик протеин эритмелеринин 1-10 мкл онлайн тузсуздандырылышы үчүн колдонулган.Тузсуздандырылган белок A буферинин (суу/0,05% кумурска кислотасы) жана В буферинин (ацетонитрил/0,045% кумурска кислотасынын) төмөнкү градиенти аркылуу Synapt G2Si масс-спектрометринин (Суулар) электроспрей ион булагына элюталанат жана мамычанын температурасы 60 ° C жана 0,1 мл/мин агымы: изократиялык түрдө 5% А менен 2 мүнөткө, андан кийин 8 мүнөттүн ичинде сызыктуу градиентти 95% Вге чейин элюциялоо жана дагы 4 мүнөт бою 95% B кармап туруу.
Массалык диапазону 500-5000 м/ц болгон оң иондор аныкталат.Glu-fibrinopeptide B автоматтык массалык дрейф коррекциялоо үчүн ар бир 45 секундада өлчөнөт.Базалык чекти алып салгандан жана текшилөөдөн кийин орточо спектрди ажыратуу үчүн MaxEnt1 кеңейтүүсү менен MassLynx аспаптык программасын колдонуңуз.
UMPylated HCoV-229E nsp9 секвенирлөө классындагы модификацияланган трипсинди (Серва) кошуу менен сиңирилди жана түнү 37 °Cде инкубацияланды.Пептиддерди тузсуздандыруу жана концентрациялоо үчүн Chromabond C18WP спиндик колонкасы (бөлүгүнүн номери 730522; Мачерей-Нагель) колдонулган.Акыр-аягы, пептид 5% ацетонитрил жана 0,1% кумурска кислотасын камтыган 25 мкл сууда эриди.
Үлгүлөр MS тарабынан Orbitrap Velos Pro масс-спектрометринин (Thermo Scientific) жардамы менен талданган.акыркы nanoâ HPLC системасы (Dionex), салт акырына орнотулган 50 см менен жабдылган ??75 μm C18 RP мамычасы 2,4 мкм магниттик мончоктор менен толтурулган (Доктор Альбин Майш High Performance LC GmbH) Proxeon nanospray булагы аркылуу онлайн режиминде масс-спектрометрге туташуу;300 мкм ички диаметрге 6 мкл трипсинди сиңирүү эритмесин сайыңыз ×??1 см C18 PepMap концентрацияга чейинки колонна (Thermo Scientific).Эриткич катары суу/0,05% кумурска кислотасын колдонуу менен үлгү автоматтык түрдө кармалып, 6 мкл/мүнөт агымында тузсуздандырылган.
300 нЛ/мин агым ылдамдыгы боюнча триптикалык пептиддердин бөлүнүшүнө жетишүү үчүн суу/0,05% кумурска кислотасынын (эритүүчү А) жана 80% ацетонитрил/0,045% кумурска кислотасынын (Б) төмөнкү градиенттери колдонулган: 4% B үчүн 5 мүнөт, андан кийин 30 А сызыктуу градиент мүнөттүн ичинде 45% В чейин жана 5 мүнөттүн ичинде 95% эриткич B чейин сызыктуу жогорулайт.Хроматографиялык колонканы дат баспас болоттон жасалган нано-эмиттерге (Проксеон) туташтырыңыз жана 2300 В потенциалын колдонуу менен элюентти масс-спектрометрдин ысытылган капиллярына түз чачыңыз. жок дегенде үч маалымат менен MS/MS скандоолору, динамикалык түрдө 30 секундага чыгарылып, сызыктуу ион капкан кагылышуудан келип чыккан диссоциациялоо же орбитрап аныктоо менен айкалышкан жогорку энергиялуу кагылышуу диссоциациясын колдонуу менен, Токтом 7,500.
Посттун убактысы: 03-03-2021